淀粉样多肽Aβ40调节小脑颗粒细胞GABA_Aα6表达的机制及发育成熟的研究

【摘要】p-淀粉样多肽最初是在阿尔兹海默病患者脑部淀粉样斑块中发现的,并被命名为β-淀粉样多肽(β-amyloidpeptide,Aβ)。Aβ由淀粉样蛋白前体蛋白剪切而成,因为蛋白肽链长度不一,所以是一类蛋白。检测到这类蛋白在脑区堆积是诊断阿尔兹海默症最有效的手段。研究这类蛋白和阿尔兹海默症的关系的文章众多。研究者发现淀粉样能够使突触功能紊乱、诱导神经元凋亡、促进氧化性脂质损伤。但同时研究人员也发现,淀粉样多肽同时具有生理功能。据报道淀粉样多肽能够调控神经突触传递；用阻断剂阻断淀粉样多肽的产生会使得神经元死亡增加,而在培液中添加淀粉样多肽后能够减少细胞的凋亡。但是关于淀粉样多肽对神经元发育成熟的调控的报道却鲜有涉及。在本人的研究中发现淀粉样多肽Aβ40能够增加GABAAa6的表达,并增加其参与介导的GABA配体门控型C1-离子电流。此外,通过生物素标记膜蛋白的方法检测到膜上GABAAa6蛋白的增加。利用westernblotting和定量PCR的方法我们检测到蛋白的增加,但其mRNA水平没有变化,cycloheximide阻断蛋白翻译后发现Aβ40的作用被抑制,所以我们初步确定Aβ40影响了GABAAa6蛋白的翻译,但不影响转录。利用U0126阻断MEK/ERK信号通路,我们发现Aβ40的作用被抑制且Aβ40提高ERK1/2磷酸化水平的现象也能被U0126阻断。利用rapamycin阻断mTOR信号途径,发现同样能够抑制Aβ40的作用,且验证mTOR信号在ERK信号下游。Co-IP实验揭示Aβ40和膜上p75受体能够相互作用,p75受体阻断抗体(blockingantibody)能够阻断Aβ40的作用,同时我们发现阻断其他几个能够和Aβ40相互作用的受体并不能阻断Aβ40的作用。利用APP基因敲除小鼠,我们检测了小脑GABAAa6蛋白的表达,发现APP基因敲除后,小脑区域GABAAa6蛋白水平下降,在APP基因敲除小鼠小脑区域注射Aβ40能够将GABAAa6蛋白表达水平明显挽回。由于GABAAa6和小脑颗粒神经元的成熟密切相关,为了进一步研究Aβ40和小脑颗粒发育成熟的关系,我们观察离体培养小脑脑片和APP基因敲除小鼠在Aβ40处理前后小脑形态学的变化。我们发现Aβ40处理的离体培养小脑脑片其外颗粒层比对照组薄,而内颗粒层增厚,这个趋势和小脑发育成熟过程一致。在APP敲除小鼠模型上,APP敲除组小鼠小脑内颗粒层薄且分层不明显,Aβ40显微注射小鼠后小脑发育情况和对照组一致。另外我们还检测了Aβ40对小脑和小脑颗粒细胞其他发育情况的影响。利用GFP转染的小脑颗粒细胞拍摄共聚焦显微照片并经三维重构后分析发现,Aβ40处理后小脑颗粒细胞上树突小棘的分布密度明显增力。NeuroD2是与神经元发育、分化密切相关的转录因子,它的表达水平与神经元的发育程度密切相关。定量PCR检测NeuroD2的mRNA水平发现,Aβ40能够在发育早期(5DIC)增加神经转录因子NeuroD2的转录。这些线索和GABAAa6的变化一起揭示Ap40和小脑的发育密切相关,有助于我们更深入地了解淀粉样肽段的生理作用。
【作者】占小琴；
【导师】梅岩艾；
【作者基本信息】复旦大学，生物物理学，2013，博士
【关键词】小脑颗粒细胞；Aβ40；小脑成熟；GABA_Aα6；小脑脑片；P75受体；

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